Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Раствор хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. 1,022 г безводного натрия гидрофосфата R, 0,336 г безводного натрия дигидрофосфата R и 8,766 г натрия хлорида R растворяют в 800 мл воды R и разбавляют до 1000 мл тем же растворителем.
Основной раствор магния и кальция. 1,103 г кальция хлорида R и 5,083 г магния хлорида R растворяют в воде и разбавляют до 25 мл тем же растворителем.
Основной буферный раствор барбитала. 207,5 г натрия хлорида R и 25,48 г барбитала натриевой соли R растворяют в 4000 мл воды R и доводят значение рН до 7,3 1 М хлористоводородной кислотой. Добавляют 12,5 мл основного раствора кальция и магния и разбавляют водой R до 5000 мл. Фильтруют через мембранный фильтр (размер пор 0,22 мкм). Хранят при 40С в стеклянных контейнерах.
Буферный раствор альбумина и барбитала. 0,150 г бычьего альбумина R растворяют в 20 мл основного буферного раствора барбитала и разбавляют водой R до 100 мл.
Раствор дубильной кислоты. 10 мг дубильной кислоты R растворяют в 100 мл раствора хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. Готовят непосредственно перед использованием.
Комплемент морских свинок. Готовят пул сыворотки из крови не менее 10 морских свинок. Сыворотку отделяют от свернувшейся крови центрифугированием при температуре около 40С. Сыворотку хранят в небольших количествах при температуре ниже -700. Непосредственно перед началом гемолиза, инициируемого комплементом, разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала до содержания 125-200 СН50 в миллилитре и хранят в процессе испытания на ледяной бане.
# СН50 (гемолитическая единица активности комплемента) - концентрация комплемента в контрольной сыворотке, вызывающая в данных реакционных условиях теста агглютинации лизис 50% эритроцитов.
Антиген краснухи. Соответствующий антиген краснухи для титрования по ингибированию гемагглютинации (HIT). Титр должен составлять более 256 НА-единиц.
Приготовление таннированных человеческих эритроцитов. Эритроциты отделяют центрифугированием соответствующего объема стабилизированной человеческой крови. Промывают клетки не менее трех раз раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2 и суспендируют в том же растворе, получая суспензию концентрацией 2 объемных процента. 0,1 мл раствора дубильной кислоты разбавляют до 7,5 мл раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2 (окончательная концентрация 1,3 мг/л). 1 объем свежеприготовленного разведения смешивают с 1 объемом суспензии эритроцитов и инкубируют при 370С в течение 10 минут. Клетки отделяют центрифугированием (400-800 g в течение 10 минут), супернатант удаляют, а клетки однократно промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2. Таннированные клетки снова суспендируют в растворе хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,2, получая суспензию концентрацией 1 объемный процент.
Покрытие антигенами таннированных человеческих эритроцитов. К
соответствующему объему (Vs) таннированных клеток добавляют антиген краснухи (0,2 мл на 1,0 мл клеток) и инкубируют при 370С в течение 30 минут. Клетки отделяют центрифугированием (400-800 g в течение 10 минут) и отбрасывают супернатант, оставляя объем 200 мкл. Добавляют буферный раствор альбумина и
барбитала, объем которого равен объему отброшенного супернатанта, клетки ресуспендируют и отделяют, как описано выше, и повторяют операцию промывки. Оставшиеся 200 мкл доводят до объема, составляющего % Vs, получая таким образом начальный объем (V). 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала смешивают с 100 мкл V, получая таким образом остаточный объем (Vr), и определяют исходную оптическую плотность при длине волны 541 нм (А). Vr разбавляют буферным раствором альбумина и барбитала с коэффициентом разведения, равным А, получая таким образом конечный корректированный объем Vf = Vr х A сенсибилизированных человеческих эритроцитов и значение А десятикратного разведения, составляющее после коррекции 1,0 ± 0,1.
Связывание антителами таннированных человеческих эритроцитов, покрытых антигенами. Готовят последовательность следующих растворов (каждый
- в двух повторностях), используя для каждого из них отдельную кювету для полумикроопределений (например, одноразового применения) или пробирку:
(1) Испытуемые растворы. При необходимости доводят значение рН испытуемого иммуноглобулина до 7, например, добавлением 1 М раствора гидроксида натрия. Объемы испытуемого препарата, содержащие 30 и 40 мг иммуноглобулина, доводят до 900 мкл буферным раствором альбумина и барбитала.
(2) Растворы сравнения. Готовят так же, как и испытуемые растворы с использованием человеческого иммуноглобулина BRP.
(3) Контроль комплемента. 900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала.
К содержимому каждой кюветы или пробирки добавляют по 100 мкл сенсибилизированных человеческих эритроцитов и хорошо перемешивают.
Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, добавляют 1000 мкл буферного раствора альбумина и барбитала, отделяют клетки центрифугированием кюветы или пробирки (1000 g в течение 10 минут) и отбрасывают 1900 мкл супернатанта. Добавляют вместо отброшенного супернатанта 1900 мкл буферного раствора альбумина и барбитала и повторяют всю операцию промывки, оставляя объем 200 мкл. Испытуемые образцы могут храниться в укупоренных кюветах (пробирках) при 40С в течение 24 часов.
